細胞凍存小tips

養細胞是個細致活，對待過程中如果一個不小心，就會讓你“不開心”，所以今天小編給大家分享一些細胞凍存的注意tips：

1、凍存細胞的效果好壞要看細胞復蘇時的存活率。細胞凍存時，細胞內部會產生晶體，水凝固形成的高濃度溶質會對細胞產生損傷，所以在凍存過程中要盡可能降低晶體的產生。為了提高復蘇存活率，可通過以下方法完成：a）降溫的速度不能太快，讓細胞內的水分緩慢離開細胞；b）在低溫環境下凍存細胞可以降低高濃度鹽對細胞中蛋白質的影響；c）凍存試劑要采用親水的低溫保護劑；d）復蘇時的速度要快，這樣可以減少細胞內部冰晶溶解時產生的某些可溶性成分。

 

2、凍存細胞是為了留種，所以要選擇高濃度的細胞量進行凍存。正常情況下，當細胞濃度達到1*105/ml時即可凍存，具體是多少量主要根據個人觀察。

 

3、二甲基亞砜（DMSO )因為穿透細胞的能力較強，因此作為常用的凍存劑，也可以叫做細胞保護劑加入到細胞懸液中。網上有些分享說道，如果選用DMSO，整個細胞懸液的制作過程都要在4℃環境下進行。本人采用過這種方法凍存過A549和某一原代細胞，發現A549復蘇存活率和正常凍存的過程相比并沒有明顯區別，而原代細胞的接種率確實有所上升，可能是因為是A549細胞比較皮實，這種方法更適用于比較脆弱的細胞吧。

 

4、凍存液比例一般是培養基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1；動物種屬的原代細胞凍存液可采用的比例是培養基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細胞再加入DMSO，盡管如此，原代細胞的復蘇成活率還是很低。

 

5、有文獻表明，細胞以l℃/min的速度冷凍存活率較髙，因為這一速度可以很好的控制細胞內部晶體的產生。我們實際操作不可能將速度控制的這么精確，目前慣用的就是4℃ 30min、-20℃ 1h30min、-80℃ 2h后轉入液氮中。

 

6、正常情況下，經過-20℃ 1h30min這一步后，凍存管內的細胞已經處于凝固狀態，如果此時凍存管內還是液體，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現了問題。如若遇到這種情況，不能因為時間到了，就把把液體狀態的凍存管放置到液氮中，可以適當延長在-20℃環境下的冷凍時間30-60分鐘，直至凍存液凝固后再放到液氮中。

 

7、凍存記錄要表明細胞的種類、凍存之前的狀態和大致數量、凍存時間和操作者。

 

8、液氮內的細胞凍存最長時間不要超過半年，凍存在液氮中的細胞應一段時間內進行更替。一個細胞系在培養一個月后，可復蘇一管新的細胞確保其質量沒有發生太大變化，傳代幾次后，再凍存留種。

 

9、細胞復蘇時，為保證獲得較高的存活率和接種率，應盡可能的快速完成復蘇，以避免在升溫過程中細胞內部晶體的產生。書面介紹的復蘇溫度是37℃-42℃，但是本人在實際操作中發現40℃環境下復蘇效果較佳。

 

10、復蘇時的凍存管一定要密封好，以免管內外溫度和壓力不同導致凍存管炸裂。

 

11、復蘇時使用的培養基和凍存時使用的培養基中的血清盡量保證同一批次。

 

12、DMSO快速稀釋會對細胞造成滲透性損傷，使存活率下降50%。對于DMSO凍存的細胞，復蘇后應緩慢稀釋成細胞懸液：1）凍存液：培養基=1:1稀釋成細胞懸液后離心，然后重懸至培養皿中培養，隔天換液；2）凍存液：培養基=1:10稀釋成細胞懸液，不用離心，直接放置到培養瓶中培養2-4小時后，換液。上述兩種方法都是比較常用的細胞復蘇方法，后者更適用于原代細胞或比較難養的細胞。

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