超敏ECL發光底物（試劑盒）

包裝規格：

產品簡介：

??超敏ECL發光底物是一種用于檢測免疫印跡膜上HRP(辣根過氧化物酶)標記的目的條帶的高靈敏增強底物。這一獨特的發光底物系統是目前最靈敏的商業化熒光ECL檢測試劑，具有極高靈敏度和高信噪比。

??產品特色：

??發光迅速：通常1-5秒既出結果;

??極高靈敏度和高信噪比;

??使用方便：可在日光燈下進行發光實驗，(短時間暴露實驗室常規照明不會損傷該試劑)。

使用方法：

??1. 將印記膜從蛋白轉印設備中取出,加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘,同時振蕩;

??2. 將膜從封閉液中取出,與一抗工作液在溫室孵育1小時,同時振蕩或在28℃孵育過夜,不振蕩;

??3. 用適當的緩沖液充分洗滌印跡膜。(將足量的洗滌緩沖液加至膜上,保證緩沖液將膜完全覆蓋,振蕩孵育>5分鐘,更換洗滌緩沖液并重復該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積,洗滌次數和洗滌時間有助于降低背景信號);

??4. 用10-50 ng/mL二抗孵育印跡膜約30-60分鐘;

??5. 重復步驟3,以除去未結合的HRP標記二抗(膜與HRP標記二抗孵育后必須進行徹底洗滌);

??6. 通過混合等份的本產品溶液A和本產品溶液B來制備發光工作溶液。每平方厘米印記膜使用0.1 mL發光工作溶液。已配制的工作溶液在室溫下可穩定保存8小時。(注:暴漏于日光或任何其他強光下可能損害工作液,為獲得最佳結果,將此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免長期暴漏于任何強光,實驗室的常見照明不會損害工作液的穩定性);

??7. 將印跡膜置于新配置的工作溶液中孵育5分鐘;

??8. 去除多余的工作溶液;

??9. 將印跡膜放在透明的塑料包裝或薄片保護膜中,去除氣泡 10將印跡暴露于X射線膠片或成像系統。

??抗體稀釋參考

??為獲得最佳顯色效果,必須優化該系統的全部組分,包括樣品量、一抗和二抗濃度以及膜和封閉試劑的類型。??注意事項

??1.使用該產品比使用沉淀比色HRP底物檢測所需的抗體濃度低。為優化抗體濃度,請進行一次系統的點印跡分析;

??2. 工作液在室溫下8小時內可以保持穩定,但是應該避免暴露在陽光下或任何其他強光環境,然而短期實驗室照明強度不會破壞工作液的穩定性;

??3. 封閉試劑有可能與抗體產生交叉反應,導致出現非特異性信號。封閉緩沖液同時也會影響系統的靈敏性,當從一種底物轉換為另一種底物時,有時會出現信號衰減或背景增加的現象,原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測系統;

??4. 使用親和素/生物素檢測系統時,避免使用牛奶作為封閉試劑,因為牛奶中含有不定量的內源性生物素,會導致高背景信號;

??5. 保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積,以確保在整個實驗過程中印跡膜完全被液體覆蓋,避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的信號;

??6. 為獲得最佳效果,在孵育步驟請使用搖床;

??7. 將Tween20(終濃度0.05-0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液,以降低非特異信號;

??8. 不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑,疊氨鈉是HRP的抑制物;

??9. 避免手與膜直接接觸,實驗過程應戴手套或使用干凈的鑷子;

??10. 所有設備必須清潔且不沾染外來物質,金屬器械(如剪刀)不得具有可見的銹跡,銹跡可能導致斑點形成和高背景。

??圖像獲取

??1. 將包在塑料紙(膜)中的印跡膜置于膠片暗盒中，蛋白質面朝上，除適用于膠片曝光的燈(如紅色安全燈)之外，關閉所有燈;

??注: 膠片必須在曝光期間保持干燥,為獲得最佳效果,采取以下措施:

??確保將多余的底物溶液從膜和塑料紙上完全去除;

??在整個膠片處理期間,使用手套;

??切莫將印記膜置于已顯影的膠片上,因為膠片上的化學物質會減弱信號。

??2. 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60秒。之后可調整曝光時間以達到最佳結果。化學發光反應在底物孵育后的前5-30分鐘期間是最強烈的,這一反應可以持續幾個小時,但強度會隨時間下降,如有底物孵育后較長時間后曝光,曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備(如Bio-Rad的分子成像儀系統)或CCD照相機可能需要較長的曝光時間;

??3. 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強,則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

??其他材料準備

??已完成轉印的印跡膜:使用任何合適的電泳法分離蛋白質,并將這些蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上,也可使用其他類型的膜,但操作步驟可能需要進行優化;

??用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

??用于孵育的旋轉搖床;

??稀釋緩沖液:使用Tris或磷酸鹽緩沖液;

??洗滌緩沖液:將5mL 10%的Tween-20加入1000 mL稀釋緩沖液(Tween-20的終濃度將為0.05%);

??封閉試劑:將0.5mL10%的Tween-20加入100 mL的封閉緩沖液,選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液;

??一抗:選擇一種目標蛋白質特異性抗體,使用稀釋緩沖液制備該抗體的1 mg/ml儲液。使用封閉試劑將抗體從儲液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于1:1,000和1:5,000之間或抗體工作液濃度為0.2-1 ug/mL。最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量;

??HRP標記的二抗:選擇一種與二抗特異性結合的HRP標記二抗,使用稀釋緩沖液制備該抗體的1 mg/ml儲備液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于 1:20,000和1:100,000之間或抗體工作液濃度為10-50ug/ml,該濃度范圍在使用鏈親和素 HRP時也適用。二抗的最佳稀釋度取決于HRP標記二抗和膜上的抗原量

??常見問題